Aprotinin CAS 9087-70-1

Aprotinin78R2S7, moleküler formül C284H432N84O, CAS 9087-70-1, Tripsin ve kimotripsini inhibe edebilen, pankreastaki diğer aktif proteozomların aktivasyonunu ve trypsinojenin kendi kendine aktivasyonunu önleyebilen bir proteaz inhibitörüdür. Akut pankreatitin, fibrinolizin neden olduğu kanamanın ve yaygın damar içi pıhtılaşmanın önlenmesi ve tedavisinde klinik olarak kullanılır. Ayrıca anti-şok tedavisi için de kullanılabilir. Proteaz inhibitörleri, enzimlere bağlanabilen ve substrat bozunma hızını azaltabilen maddelerdir. Protein özelliklerine sahip proteaz inhibitörleri yaygın olarak mevcuttur ve soya fasulyesinden protein özelliklerine sahip iki tip proteaz inhibitörü izole edilmiştir: Kuniz trypsin inhibitörü ve Baumann Bellck inhibitörü. Birincisinin molekül ağırlığı 20-25 ku, ikincisinin molekül ağırlığı ise 8 ku'dur.

Rekombinantaprotinin(RTI16), kininaz ve trypsin'i inhibe edebilir ve doğal, spesifik olmayan bir serin proteaz inhibitörüdür. Zincirde çapraz bağlı 3 disülfit bağıyla 58 amino asit kalıntısından oluşan tek zincirli bir bazik proteindir. Aprotin uzun süredir akut pankreatit tedavisinde kullanılmaktadır. 1990'lı yıllardan sonra rekombinant aprotin, kardiyotorasik cerrahide trombositleri korumak, kanama ve eksüdasyonu azaltmak ve pıhtılaşma bozukluğu olan hastaların klinik tedavisinde kullanılmaya başlandı. Bu nedenle aprotininin pazar büyüklüğü hızla genişlemiş ve önemli biyokimyasal ilaçlardan biri haline gelmiştir.

Sentez

 

Şu anda, ticari olarak temin edilebilen rekombinant aprotin preparatları esas olarak sığır akciğerleri gibi karmaşık proseslere ve yüksek maliyetlere sahip organlardan elde edilen ekstraktlardır. Bu nedenle rekombinant aprotin üretiminin genetik mühendisliği yöntemleri kullanılarak araştırılması büyük önem taşımaktadır.

Bir salgı ekspresyon sistemi kullanıldığında aprotin üretimi genellikle düşüktür ve elde edilen ürünün aktivitesi de düşüktür. Füzyon ekspresyonu yoluyla, rekombinant aprotininin ekspresyon düzeyinin büyük ölçüde artması beklenmektedir.

 

Bu amaç için bir rekombinant aprotinn ekspresyon plazmidi pGrxA BPTI oluşturuldu ve füzyon partneri ile rekombinant aprotin arasında FXa için bir tanıma bölgesi tasarlandı. İnklüzyon cisimciği formunda ifade edildikten sonra füzyon partneri saflaştırıldı ve jel filtrasyonu yoluyla yeniden katlandı. Füzyon ortağı, doğal ürünle aynı aktiviteye sahip bir protein elde etmek için FXa ile çıkarıldı. İfade koşullarının optimizasyonu yoluyla verim, önceki ifade sistemleriyle karşılaştırıldığında önemli ölçüde iyileştirildi.

Mühendislik bakterilerinin ekspresyonunun optimizasyonu:

 

Gliserol tüpü bakterilerini LB/AMP agar plakalarına aşılayın, 37 derecede 20 saat kültür yapın, kolonileri kazıyın ve bunları 37 derece, 200 r/dak'da 5 mL LB/AMP sıvı ortamına aşılayın ve gece boyunca kültür yapın. Aşının %5'ini 100 mL mısır bulamaç ortamına aşılayın, bir çalkalayıcıda 37 derece ve 220 r/min'de kültür yapın, 7 saat boyunca indükleyin ve ardından bakteriyel hücreleri toplamak için santrifüjleyin (8000 r/min, 5 dakika, 4 derece). Bakteri hücrelerinin ıslak ağırlığını tartın ve ekspresyonlarını %15 SDS-PAGE ile tespit edin.

Fermantasyon tankı yetiştiriciliği

 

Fermantasyon tankı ekimi:

Alman Biostat 30 L fermantasyon tankı kullanılarak, 37 derecede, çözünmüş oksijen %20, pH 7,0'da kontrol edildi. Füzyon proteinini eksprese etmek için bir fermantasyon tankı kullanılarak, 16 L fermantasyon et suyundan, yaklaşık 16 g/L'den 260 g ıslak bakteri hücresi elde edildi; İfade düzeyi yaklaşık %45'tir,

Bakteri hücrelerinin duvarını kırma ve dahil etme gövdesi edinimi:

 

Yetiştirme tamamlandıktan sonra bakteri hücrelerini toplayın, 10 mL A çözeltisine (50 mmol/L Tris HCl, pH 8.0, 1 mmol/L EDTA) 1 g bakteri hücresi ekleyin, iyice askıya alın, hücreleri buz banyosunda sonikasyona tabi tutun, 30 saniye çalışın, 10 saniye aralıklarla, güç 400 W, 30 döngü. Sıvıyı bir santrifüj tüpüne aktarın, 4 derecede ve 8000 devir/dakikada 15 dakika boyunca santrifüj edin ve çökelti, ham inklüzyon gövdesini oluşturur.

İnklüzyon cisimciği çözünme çözeltisinin hazırlanması:

 

Ham ekleme gövdesini çözelti B (50 mmol/L Tris HCl, pH 8,0, 1 mmol/L EDTA, %1 Triton-X100) ile iki kez, her seferinde 0,5 saat yıkayın, süpernatantı çıkarmak için santrifüjleyin ve nispeten saf ekleme gövdeleri elde edin. 5 mL çözelti C'ye (50 mmol/L Tris HCl, pH 8,0, 8 mol/L üre, 1 mmol/L EDTA, 5 mmol/L DTT) 1 g ekleme gövdesi ekleyin, gece boyunca 4 derecede kuluçkaya yatırın, denatüre edin ve çözün, 15 dakika boyunca 12000 r/min'de santrifüj edin ve dahil etme gövdesi çözünme çözeltisini elde etmek için süpernatantı toplayın. Rekombinant aprotin elde edin.

Farmakolojik etkiler:

 

 

Aprotininbelirli bir kimyasal oranda oluşturduğu geri dönüşümlü enzim inhibitör kompleksleri yoluyla insan trypsin, fibrinolitik enzim, plazma ve doku anjiyotensini inhibe eder. Serin aktivitesine sahip proteazlar, plazmin ve plazma vazopressinin kritik rol oynadığı vazopressin kininojen kinin sisteminde, kompleman sisteminde ve pıhtılaşma sisteminde önemli bir rol oynar.

 

Aprotin, inhibitör etkisini, enzim üzerindeki serin aktif kısım yoluyla bir aprotin proteaz kompleksi oluşturarak gösterir. Ancak farklı proteazlarla birleştirildiğinde farklı ayrışma sabitleri sergiler. Tripsin ile bağlanma en güçlü olanıdır (Ki=0.06nmoN), bu da protein-protein etkileşimlerinde rapor edilen en düşük sabitlerden biridir (Laydunski ve diğerleri. 1974). İnsan fibrinolitik enzimi ile bağlanma çok güçlü değildir. Enzim inhibitör kompleksinin (Ki=1 nmol/N) yüksek K değeri nedeniyle, bu durum tersine çevrilebilir (Wimann, 1980) ve insan plazması anjiyotensinine bağlanan kompleks oldukça zayıftır (Ki=30 nmol/l), fakat yine de aprotinnin terapötik aralığı içindedir (Nakahara, 1983).

 

Aprotin sadece serbest enzim moleküllerine değil aynı zamanda üçüncü bir bileşene bağlanmış olan enzimlere de bağlanır (enzimin aktif merkezi hala bağlanma yeteneğine sahipse). Bu nedenle aprotin, serbest fibrinolitik enzimleri inhibe eder ve ayrıca zincir kinaz ile trombolitik tedavi sırasında oluşan ara fibrinolizin zincir kinaz kompleksini de inhibe edebilir (Wimann, 1980).
Aprotinin anti fibrinolitik etkisi, protein hidrolizi ile aktive edilen plazminin inhibisyonuna dayanmaktadır. Sentetik anti fibrinolitik solventlerin aksine, aşırı aktifleştirilmiş plazmini doğrudan inhibe etmesi nedeniyle aprotinn, yalnızca doğrudan substratı (fibrini) plazmin tarafından parçalanmaktan korumakla kalmaz, aynı zamanda fibrinojeni, plazmadaki faktör V ve VIII'i ve serumdaki alfa 2-globülini de korur.

 

Endotoksin kaynaklı şok ve hipovolemik şok deneylerinde Trasylol, kininojenin aktivasyonunu önemli ölçüde inhibe edebilmektedir. (Massion ve diğerleri1．1972).
Trasylol, pulmoner interstisyel ödemin (şok akciğer) gelişimini önleyebilir veya geciktirebilir. İnhibitör etkisi doza-bağımlı ve zamana-bağlıdır (Lorthioir ve diğerleri, 1973).
Şok sırasında iskemik pankreas, miyokardiyal inhibitör faktör (MDF) adı verilen oldukça toksik bir peptit maddesi üretebilir. Bu faktör şoktan ölümle yakından ilişkilidir.

 

MDF farelerin, köpeklerin, maymunların ve insanların plazmasında hemorajik, septik, kardiyojenik şok ve yanık şokunda tespit edilebilmektedir. MDF, tüm kanama vakalarında miyokard kontraktilitesinde azalmaya neden olabileceği gibi aynı zamanda visseral direnç damarlarının da kasılmasına neden olarak lokal iskemiye ve daha fazla MDF üretimine neden olabilir. Ayrıca retiküloendotelyal sistemde oluşan toksik hasar nedeniyle kan dolaşımında temizlenmesi gecikir. Trasylol, MDF üretimini büyük ölçüde önleyebilir (Lefer 1984).

AprotininFibrinolize dirençli küçük moleküllü bir bileşik olarak önemli ve spesifik enzim önleyici özellikler sergiler. Tripsin aktivitesini etkili bir şekilde engellemekle kalmaz, aynı zamanda diğer ilgili proteolitik enzimler üzerinde de geniş ölçüde etki göstererek hücre biyolojisi deneylerinde önemli bir rol oynar. Aprotinn, özellikle hücre ve doku lizizi ve homojenizasyon sırasında etkili bir proteaz inhibitörü olarak görev yapabilir ve hedef proteinlerin kazara bozulmasını etkili bir şekilde önleyebilir; bu, numune bütünlüğünün ve doğruluğunun korunması için çok önemlidir.

Aprotinn'in inhibitör etkisi açık bir doza bağımlılık gösterir; yani konsantrasyonu arttıkça fibrinolitik aktivite üzerindeki inhibitör etkisi de buna göre artar. Bu özellik, araştırmacıların daha güvenilir ve tekrarlanabilir deneysel sonuçlar elde etmek için deney koşullarını daha doğru bir şekilde kontrol etmelerini sağlar. Bu arada Aprotinn ayrıca kanın pıhtılaşma süresini uzatabilir ve bu da onun pıhtılaşma mekanizmasındaki önemli rolünü daha da doğrular. İn vitro deneyler Aprotinn'in pıhtılaşma sürecindeki önemli süreçlere müdahale edebilen ve bunları düzenleyebilen etkili bir endojen pıhtılaşma yolu inhibitörü olduğunu göstermiştir.

Aprotini ayrıca benzersiz farmakolojik etkilerini de göstermiştir. Laboratuvar ortamında kan pıhtısı çözünme sürecini önemli ölçüde engelleyebilir, sıçanlarda kuyruk kesme kanama süresini uzatabilir ve insan plazmasındaki pıhtılaşma süresini uzatabilir. Bu bulgular Aprotinn'in potansiyel anti kanama ve anti trombotik etkilere sahip olabileceğini düşündürmektedir. İn vivo etkisini daha da doğrulamak için araştırmacılar, sıçan arteriyovenöz kısa devre modelinde deneyler yaptılar. Sonuçlar, Aprotnin'in kan pıhtılarının ağırlığını önemli ölçüde azaltabildiğini ve antitrombotik bir ilaç olma potansiyelini daha da desteklediğini gösterdi.

Özetle, fibrinolizi inhibe eden küçük moleküllü bir bileşik olan Aprotnin, hem in vitro hem de in vivo olarak önemli enzim inhibitör özellikleri ve farmakolojik etkiler göstermiştir. Hücre biyolojisi deneylerinde uygulanması araştırmacılara güçlü araçlar sağlarken, in vivo çalışmalarda elde edilen bulgular, bir anti kanama ve anti trombotik ilaç olarak geliştirilmesi için önemli ipuçları ve temel sağlar. Gelecekte, Aprotnin'in etki mekanizmasına ilişkin daha fazla araştırma ve klinik çalışmalarla, onun tıp alanında daha geniş uygulamasını görmemiz bekleniyor.

Popüler Etiketler: aprotinin cas 9087-70-1, tedarikçiler, üreticiler, fabrika, toptan satış, satın al, fiyat, toplu, satılık