Streptavidin Sigma CAS 9013-20-1

1. Streptavidin'i tanıyın
Streptomyces avidinii'den türetilen salgılanan bir protein olan Streptavidin (SA), yaklaşık 65-66 kDa'lık bir moleküler ağırlığa ve 6,0 civarında bir izoelektrik noktaya sahiptir. Bu, her biri bağımsız bir biyotin bağlama alanına sahip dört homolog alt birimden oluşan bir tetramer proteinidir; bu, bir streptavidin molekülünün aynı anda dört biyotin molekülüne bağlanabileceği anlamına gelir. İkisi arasındaki ayrışma sabiti (Kd) yaklaşık 10 ⁻¹⁵ M kadar düşüktür; bu, bilinen en güçlü kovalent olmayan biyolojik etkileşimlerden biridir ve doğadaki en hassas "moleküler kilitleme mekanizması" olarak kabul edilebilir.

Yumurta beyazından elde edilen avidin ile karşılaştırıldığında benzersiz avantajlara sahiptir:

Glikosilasyon modifikasyonları içermez, genel olarak elektriksel olarak nötrdür, bu nedenle fizyolojik koşullar altında son derece düşük-spesifik olmayan bağlanmaya, temiz deneysel arka plana ve mükemmel sinyal-gürültü oranına- sahiptir. Ek olarak, denatürasyona ve proteaz bozulmasına karşı mükemmel direncinin yanı sıra aşırı pH'a, yüksek sıcaklıklara (70-80 derece C), organik çözücülere ve geleneksel denatüre edici maddelere (SDS ve üre gibi) dayanma yeteneği, avidinin yerini almış ve biyotin bağlama sistemlerinde tartışmasız "altın standart" haline gelmiştir.

Yaşam bilimleri, in vitro teşhis, ilaç taraması ve biyoalgılama gibi alanlarda öne çıkan özelliği tam da bu olağanüstü özellikleridir.

2. Bağışıklık testi
Bağışıklık tespiti alanındaki uygulama en klasik ve en yaygın kullanılan uygulamasıdır. Biyotin streptavidin sistemi (BAS), 1970'lerin sonlarında geliştirilmesinden bu yana, ultra-yüksek afinitesi ve kademeli amplifikasyon etkisi nedeniyle bağışıklık etiketleme ve izleme analizinin temel taşı haline geldi. İstatistiklere göre, yaygın kemilüminesans analizörlerinin yaklaşık %85'i, baskın konumlarını gösteren BAS tabanlı tespit yöntemlerini kullanıyor.

2.1 Enzime bağlı immünosorbent tahlili (ELISA)

ELISA'da yaban turpu peroksidaz (HRP) veya alkalin fosfataz (AP) birleştirilebilir ve enzim, biyotinlenmiş antikorlar aracılığıyla hedefe hassas bir şekilde yönlendirilebilir. HRP, güçlü kimyasal veya optik sinyaller üretmek için TMB, DAB veya ECL ışıldayan substratları katalize ederken, AP, stabil renk veya kemilüminesans sinyalleri üretmek için BCIP/NBT, PNPP ve diğer substratları katalize eder. Biyotinlenmiş bir hedef molekül, birden fazla etiketli streptavidine bağlanarak çok-seviyeli sinyal amplifikasyonu elde edebilir ve düşük bolluktaki hedeflerin tespitini mümkün kılar. Bu teknoloji, protein ölçümü, antikor tespiti, patojen taraması vb. senaryoları kapsayan sandviç ve rekabetçi ELISA'da yaygın olarak kullanılmaktadır.

2.2 Protein immünoblotlama (Western Blot)
Western Blot'ta biyotinlenmiş ikincil antikorlarla bağlanma, transfer filmleri üzerindeki hedef proteinlerin sinyal yoğunluğunu önemli ölçüde artırabilir. Geleneksel ikincil antikor sistemleriyle karşılaştırıldığında BAS sistemleri, dört değerlikli bağlanma özellikleri nedeniyle daha güçlü sinyal amplifikasyonu elde edebilir. Ek olarak, streptavidinin spesifik olmayan düşük-bağlanması nedeniyle, arka plan girişimi önemli ölçüde azalır ve bu da onları özellikle düşük bolluktaki proteinlerin kantitatif analizi için uygun hale getirir.

2.3 İmmünohistokimya (IHC) ve İmmünositokimya (ICC)
HRP etiketli veya AP etiketli streptavidin, IHC ve ICC için tercih edilen sinyal amplifikasyon aracıdır. HRP sistemi son derece yüksek algılama hassasiyeti gerektiren deneyler için uygundur; AP sistemi ise özellikle HRP inhibitörleri (sodyum azit gibi) içeren sistemler veya uzun-dönemli renk gelişimi ve sinyal stabilitesi gerektiren deneysel senaryolar için uygundur. Biyotinlenmiş probların veya antikorların streptavidin konjugatlarına bağlanmasıyla hedef moleküller doku kesitlerinde veya hücre numunelerinde doğru bir şekilde konumlandırılabilir.

2.4 İmmünofloresan (IF) ve yerinde hibridizasyon (ISH)

Floresein etiketli streptavidin (FITC Streptavidin, PE Streptavidin, APC Streptavidin gibi), immünofloresan boyama ve yerinde hibridizasyon için evrensel bir görselleştirme aracıdır. FITC işaretçisi yaklaşık 494/519 nm'lik bir uyarılma/emisyon dalga boyuna sahiptir ve parlak yeşil floresans sergiler; PE işaretleyicisinin uyarılma/emisyon dalga boyu yaklaşık 565/578 nm'dir; bu, çok-renkli akış sitometri analizi için "altın standarttır"; APC işaretçisi uzak kırmızı spektrumu kapsayarak çok-renkli görüntülemeyi kolaylaştırır. Bu floresan işaretleyiciler, hedef moleküllerin lokalizasyon analizini ve kantitatif tespitini gerçekleştirmek için biyotinlenmiş antikorlara veya nükleik asit problarına doğru bir şekilde bağlanabilir.

2.5 Akış sitometrisi (FACS)

Akış sitometrisinde, biyotinlenmiş antikorlarla etiketlenmiş hücre yüzeyi antijenlerini tespit etmek için floresan etiketli streptavidin (özellikle PE etiketli) kullanılır. Mükemmel parlaklığı, son derece yüksek bir sinyal-gürültü- oranı sağlar; bu, düşük yüzey antijeni ifadesine veya zayıf sinyallere sahip hücre popülasyonlarını etkili bir şekilde tespit edebilir. Çok-renkli akış sitometri analizinde vazgeçilmez bir reaktiftir.

2.6 Enzim bağlantılı İmmünospot Testi (ELİSPOT)
AP etiketli streptavidin, ELISPOT'ta mükemmel performans sergiler ve katı{0}faz analizi ve doku/hücre boyama sistemleri için uygundur. Tek-hücre seviyesinde sitokin salgısının tespiti için sayılabilir nokta sinyallerinin substrat üretimini stabil bir şekilde katalize edebilir.

3. Proteinlerin ve nükleik asitlerin saflaştırılması
3.1 Afinite kromatografisi ve protein saflaştırması
Streptomisin, afinite kromatografi paketlemesinin temel bileşenidir. Saflaştırılacak proteini biyotin etiketledikten sonra streptavidin agaroz jeli (Streptavidin Agaroz/Sefaroz gibi) ile karıştırılır ve etiketlenen protein, dolgu maddesi üzerindeki streptavidine yakından bağlanacaktır. Safsızlıkları gidermek için yıkama ve ardından hedef proteini uygun koşullar altında (kaynayan SDS-PAGE tamponu, %0,1 SDS işlemi veya pH 8,2'de %95 formamid+10 mM EDTA işlemi gibi) yıkayarak, yüksek-saflıkta ürünler elde edilebilir.

Rekombinant insan insülininin endüstriyel üretimini örnek alırsak, yüksek-kaliteli streptavidin manyetik boncukları miligram başına 1200 pmol'den fazla serbest biyotin bağlayabilir ve saflaştırılmış protein saflığı %95'in üzerine çıkabilir.

3.2 İmmünopresipitasyon (IP) ve kromatin immünopresipitasyonu (ChIP)
Streptavidin manyetik boncuklarının immünopresipitasyonda uygulanması deneysel verimliliği büyük ölçüde artırır. Araştırmacılar biyotinlenmiş antikorları streptavidin manyetik boncuklarına sabitleyebilir ve bunları hücre lizatı ile birlikte inkübe edebilir.

Antikorlar spesifik olarak hedef proteini ve onun etkileşime giren proteinlerini yakalayarak bir "manyetik boncuk antikor hedef proteini" kompleksi oluşturur. Basit bir işlem ve yüksek hassasiyetle, harici bir manyetik alanın etkisi altında hızlı bir şekilde ayrılabilir. ChIP deneylerinde, biyotinlenmiş DNA protein komplekslerini yakalamak ve proteinler ile DNA arasındaki etkileşimi incelemek için streptavidin manyetik boncukları da kullanıldı.

3.3 Aşağı çekme deneyi
Protein-protein etkileşimleri çalışmasında, manyetik boncuklar biyotinlenmiş yem proteinlerini yakalayabilir ve daha sonra onlarla etkileşime giren ön proteinler için "balık" yapabilir. Örneğin, tümör hücrelerindeki anahtar sinyal yolakları incelenirken, P53 proteinini tanıyan spesifik antikorlar, streptavidin manyetik boncuklar üzerinde immobilize edilir ve P53'ü ve bununla ilişkili proteinleri etkili bir şekilde zenginleştirmek için tümör hücresi lizatı ile birlikte inkübe edilir. Geleneksel immünopresipitasyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında, manyetik boncuk IP'si daha yüksek hassasiyete ve özgüllüğe sahiptir ve düşük bolluktaki hedef proteinleri daha etkili bir şekilde zenginleştirebilir.

3.4 RNA Aşağı Çekme-
Manyetik boncuklar aynı zamanda RNA aşağı çekme-deneyleri için de uygundur. Streptavidin manyetik boncuklarıyla bağlandıktan sonra, biyotinlenmiş RNA probları, RNA protein etkileşim ağlarını incelemek için hücre lizatlarından RNA ile etkileşime giren proteinleri yakalayabilir.
3.5 Tek sarmallı DNA hazırlama ve nükleik asit ekstraksiyonu
Tek sarmallı DNA'nın hazırlanması ve nükleik asitlerin etkili bir şekilde ekstraksiyonu için biyotinlenmiş oligonükleotidlere bağlanabilir, moleküler klonlama ve genetik mühendisliğinde önemli bir rol oynar.

4. Yüksek verimli tespit ve ilaç taraması
4.1. TR-FRET test platformu
TR-FRET (zamanla-zamanla çözülmüş floresans rezonans enerji aktarımı) algılama sisteminde sinyal bağlantısı ve moleküler yakalama gerçekleştirmek için europium şelatları gibi ışıldayan şelatlarla birleştirilebilir. Örneğin, THUNDER ™ TR-FRET deney platformu için özel olarak tasarlanan europium etiketli streptavidin, çeşitli biyotinlenmiş modifiye moleküllere stabil bir şekilde bağlanabilir ve protein etkileşim analizinde ve hedef ilaçların ön taramasında yaygın olarak kullanılır.

Bu sistemin homojen ve yüksek{0}verimli olması, onu modern ilaç geliştirme için güçlü bir araç haline getiriyor.

4.2 Hedeflenen ilaç dağıtımı
Biyotin bağlama özellikleri onu ilaç hedefli dağıtım sistemleri için ideal bir taşıyıcı haline getirir. İlaç moleküllerini biyotin ile birleştirerek ve streptavidinin hedeflenen bağlanma yeteneğinden yararlanarak, hassas ilaç dağıtımı sağlanabilir, bu da tedavi verimliliğini artırır ve yan etkileri azaltır.

4.3 Biyosensörler ve Biyoçipler

Biyosensörlerin ve biyoçiplerin üretimi için temel malzemedir. Bir yakalama elemanı olarak çipin yüzeyinde streptavidin hareketsiz hale getirilerek, biyotin etiketli protein probları veya antikorlar bunun üzerine hareketsiz hale getirilerek yüksek-verim ve yüksek-hassasiyet tespiti elde edilebilir. Örneğin, protein çiplerinin kardiyovasküler hastalıklara yönelik erken taramasında, streptavidin manyetik boncukları çip substratı üzerine sabitlenir ve biyotinlenmiş protein problarını bağlamak için kullanılır. Bu, hastalığın erken evrelerinde ve kan belirteç konsantrasyonlarının cTnI'nin 0,01 ng/mL'ye kadar düştüğü durumlarda hastalardaki anormallikleri doğru bir şekilde tespit edebilir ve geleneksel teşhis yöntemlerine kıyasla teşhis penceresini 2-3 saat uzatır.

5. Hücre Biyolojisi ve Görüntüleme
5.1 Hücre yüzeyi etiketleme ve floresan hücre sınıflandırması
Floresan etiketli streptavidin (Vari Fluor 488 Streptavidin gibi), hücre yüzeyi etiketlemesi ve floresan hücre sınıflandırması için yaygın olarak kullanılır. Emisyon spektrumu, görünür ve yakın-kızılötesi ışık spektrumunun tamamını kapsar ve çok-renkli etiketleme deneylerinde, çekirdeğe ve sitoplazmik yapıya kolayca girebilir, görüntüleme ve analiz için hedef proteinleri etiketleyebilir.

5.2 Nanoteknoloji ve Malzemenin Kendiliğinden Düzenlenmesi
Dört değerlikli bağlanma özellikleri onu nanomalzemelerin kendiliğinden-birleşmesi için ideal bir "köprü" haline getirir. Biyotin streptavidin'in hedeflenen bağlanması yoluyla, biyolojik görüntüleme ve çevresel izleme gibi disiplinlerarası araştırmalar için çeşitli nanoyapılar oluşturulabilir.

6. Anti streptavidin antikoru
Streptavidin biyotin sisteminin yaygın kullanımıyla birlikte sıklıkla gözden kaçırılan bir sorun ortaya çıkmıştır: - numunedeki endojen anti streptavidin antikorları (ASA) tespit sistemini etkileyebilir. Araştırma, reaksiyon sisteminde ASA'nın SA'ya bağlanmasının spesifik antijen antikor sistemlerinin doğru yapısını etkileyebileceğini ve bunun sonucunda birleştirme, tespit veya teşhis sonuçlarının doğruluğunun tehlikeye atılmasına neden olabileceğini bulmuştur.

Bu zorluğun üstesinden gelmek için, hasta örneklerinde endojen ASA'yı tespit etmek ve bunun BAS sistemine müdahalesini önlemek için kullanılabilen anti streptavidin antikor tespit kitleri ortaya çıktı. Roche Custom Biotech, ASA girişimini spesifik olarak bloke etmek ve ortadan kaldırmak için ek adımlar olmadan mevcut sisteme eklenebilen, tespit sisteminin doğruluğunu ve özgüllüğünü artıran, aktif olmayan bir streptavidin mutantı (Streptavidin rec. inaktif, poli) geliştirmiştir.

7. Biyotin girişimi
Streptavidin biyotin sistemi güçlü olmasına rağmen, giderek daha ciddi bir sorun olan - biyotin müdahalesiyle karşı karşıyadır.

Test örneğinde yüksek konsantrasyonda serbest biyotin bulunduğunda, streptavidinin bağlanma bölgesi için biyotinlenmiş antikorlarla rekabet eder, bu da hatalı tespit sonuçlarına neden olur.

100 mg biotin'in ağız yoluyla uygulanması, 375-450 ng/mL'lik bir tepe plazma konsantrasyonuna yol açabilir; Multipl sklerozlu hastalar günde 300 mg/gün oral alabilirler ve plazma biotin düzeyleri 1000 ng/mL'yi aşabilir; Günlük 500 mg biyotin alımı kanda aşırı yüksek biyotin konsantrasyonuna yol açabilir. Sandviç immünolojik testlerinde aşırı biyotin hatalı düşük sonuçlara neden olabilir; Rekabetçi immünolojik testlerde hatalı yüksek sonuçlara yol açabilir.

Çok sayıda çalışma, TSH, Tiroksin PTH, adrenokortikotropik hormon, prolaktin, testosteron, kortizol gibi Endokrin testlerinin yanı sıra tümör belirteçleri ve kardiyak fonksiyonel belirteçlerin biyotin etkileşiminden değişen derecelerde etkilendiğini göstermiştir. FDA art arda uyarı bilgileri ve ilgili yönergeleri yayınladı. Başa çıkma stratejileri şunları içerir: numunelerin seri seyreltilmesi, sıvı kromatografi-kütle spektrometresi gibi BAS dışı yöntemlere geçiş, biyotin temizlendikten sonra yeniden test yapılması (2 saat kadar kısa, 15 gün, hatta ay kadar uzun) veya serbest biyotin temizleyicilerin kullanılması.